Secuenciación masiva

Descripción General

La secuenciación masiva, o secuenciación de nueva generación (NGS) por calco de su nomenclatura en inglés, es un concepto que engloba diferentes procedimientos que se utilizan para obtener una secuencia de los nucleótidos del ADN con el objetivo de analizar sus genes para relacionarlos con el desarrollo de enfermedades o trastornos. Su principal aplicación es el diagnóstico clínico.

El avance más significativo de la secuenciación masiva consiste en tener la posibilidad de analizar de forma paralela una gran cantidad de secuencias de ADN o genes concretos. El material genético del paciente se compara con un fenotipo similar para establecer la existencia o no de alteraciones. En el caso de obtener un resultado negativo, se debe valorar si existen fundamentos suficientes como para ampliar los estudios mediante una secuenciación del exoma o un análisis del genoma completo.

Las técnicas más utilizadas en la secuenciación masiva son:

• Secuenciación por síntesis o polimerización: es útil para analizar fragmentos pequeños de ADN. En estos procesos, se utiliza una ADN polimerasa, que es un tipo de enzima que interviene en la replicación del ácido desoxirribonucleico, para que sirva como molde o plantilla.
• Secuenciación en tiempo real: es un proceso muy rápido, ya que no es necesario parar la división para incorporar una nueva base o hacer una lectura. Para poder registrar la señal fluorescente, se utiliza un dispositivo que limita el campo de visión a los nucleótidos que se acaban de agregar.

Su capacidad de hacer diagnósticos cada vez más precisos y de ofrecer información relevante para que los tratamientos se adapten a las características concretas de cada paciente hacen que la NGS sea una de las bases de la medicina personalizada.

La secuenciación masiva comenzó a desarrollarse en los años 70 del siglo XX, aunque su uso no se ha extendido hasta principios del siglo XXI. Se trata, por lo tanto, de un proceso en expansión que avanza y encuentra nuevas aplicaciones continuamente.

¿Cuándo está indicada?

La secuenciación masiva tiene aplicaciones muy diversas, por lo que está indicada en casos como los siguientes:

• Cuando existe la sospecha de que el paciente tenga una enfermedad genética que pueda diagnosticarse mediante procesos de genética molecular.
• En pacientes oncológicos, se recomienda para detectar las mutaciones que intervienen en el desarrollo del cáncer, ya que permiten aplicar tratamientos personalizados.
• En el diagnóstico microbiológico de enfermedades infecciosasEnfermedades infecciosasEnfermedades infecciosas .
• Para la identificación de individuos en medicina forense.
• En trasplantes, para determinar el tipaje HLA y mejorar la compatibilidad entre el donante y el receptor.
• En el diagnóstico prenatal.

¿Cómo se realiza?

Cada procedimiento utilizado en la secuenciación masiva sigue unos procesos diferentes. Los más destacados son:

• Secuenciación por síntesis o polimerización:
  • Secuenciación por ion conductor: consiste en la identificación de los cambios de pH durante la síntesis de ADN. Para conseguirlo, se añaden nucleótidos (moléculas formadas por una base nitrogenada, un grupo fosfato y una molécula de azúcar simple) que propician la liberación de un protón y modifican el potencial de hidrógeno. Este proceso se repite varias veces para añadir un tipo de nucleótido cada vez y, de este modo, poder identificarlo.
  • Secuenciación por terminación cíclica reversible: se añaden nucleótidos terminadores marcados con moléculas fluorescentes. Hasta que no se registra la señal luminosa, no se retiran las moléculas marcadas y se añade un nuevo nucleótido.

• Secuenciación en tiempo real:
  • Secuenciación de una sola molécula de ADN: se añaden nucleótidos marcados a una cadena de ADN mientras se encuentran en proceso de síntesis, es decir, formando nuevas moléculas de ácido desoxirribonucleico. Se utiliza un soporte con pocillos en los que se anclan las ADN polimerasas a las que se unen fragmentos del ADN objeto de estudio formando una cadena cerrada en forma de círculo. Al añadir los nucleótidos marcados al pocillo, se activa la fluorescencia y se obtiene la secuencia de cada uno de los fragmentos.
  • Secuenciación basada en nanoporos: se hace pasar una cadena de ADN a través de una proteína de membrana para analizar los cambios que se producen en la corriente eléctrica durante el proceso. Con ayuda de un dispositivo dotado de un algoritmo específico, se visualizan las secuencias de nucleótidos.

La información obtenida mediante estas técnicas, se almacena por los dispositivos tecnológicos en ficheros de diferentes características:

• Fichero FASTQ: guarda los datos en bruto sobre las secuencias de ADN y su calidad en forma de texto.
• Fichero SAM: muestra alineamientos de secuencias, es decir, compara un fragmento de ADN del paciente con otro de referencia.
• Fichero BAM: guarda los datos del fichero SAM de forma comprimida. Para facilitar su consulta, se puede establecer un índice de las posiciones genómicas con acceso directo.
• Fichero VCF: es más flexible, por lo que puede almacenar variaciones de las secuencias de ADN con respecto a los genes con los que se compara, así como anotaciones específicas.

Riesgos

La secuenciación masiva no afecta a la salud de los pacientes. El riesgo reside en que sea imposible analizar la secuencia solicitada. Además, solamente estudia una parte del genoma, por lo que pueden existir anomalías en otros genes que no formen parte del estudio.

Qué esperar de la secuenciación masiva

Para hacer un estudio genético de secuenciación masiva, se toma una muestra del paciente que, en la mayoría de los casos, es una pequeña cantidad de sangre periférica. La extracción se hace de la misma forma que en los análisis rutinarios:

• Se coloca el brazo estirado con el puño apretado.
• Se coloca una goma por encima del codo.
• Se introduce una aguja en una de las venas de la parte posterior del codo, momento en el que se siente un leve pinchazo.
• Se abre la mano y se suelta el torniquete.
• Se recoge la sangre que fluye en un tubo de tapa lila, que contiene EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), un anticoagulante que mantiene la muestra en estado líquido durante más tiempo.

Dependiendo de las secuencias que se analicen y del proceso que se lleve a cabo, los resultados pueden tardar alrededor de dos semanas. Estos resultados pueden clasificarse en cinco categorías: variante patogénica (VP), variante probablemente patogénica (VPP), variante de significado incierto (VSCI), variante probablemente benigna (VPB) o variante benigna (VB). Un especialista debe valorarlos para determinar los siguientes pasos.

Especialidades en las que se solicita la secuenciación masiva

La secuenciación masiva es una técnica utilizada en genética para apoyar en el diagnóstico de patologías propias de la oncología, la microbiología o la medicina interna, entre otras especialidades.